聚焦蛋白質(zhì)互作研究進展與實驗方法

研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活動的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)是生物信息調(diào)控的主要實現(xiàn)方式，是決定細胞命運的關(guān)鍵因素。檢測蛋白質(zhì)間相互作用的實驗方法有哪些？這些檢測方法各有什么優(yōu)缺點?總結(jié)如下。

1. 生化方法

●共純化、共沉淀，在不同基質(zhì)上進行色譜層析(需要補充)

●蛋白質(zhì)親和色譜 基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose)，當(dāng)細胞抽提液經(jīng)過改基質(zhì)時，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來。

GST pull down技術(shù)：為了更有效的利用蛋白質(zhì)親和色譜，可以將待純話的蛋白以融合蛋白的形式表達，即將"誘餌“蛋白與一種易于純化的配體蛋白融合。例如與GST融合的蛋白再經(jīng)過GSH的色譜柱時，就可以通過GST和GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)載有細胞抽提物經(jīng)過柱時，就可以得到能夠與“誘餌"蛋白相互作用的目標(biāo)蛋白了。

Epitope-tag技術(shù)：表位附加標(biāo)記技術(shù) 就是將附加的抗原 融合到目的蛋白以檢測目的蛋白的表達，同時還可以通過親和層析法來純化目的蛋白。 缺點：表位附加標(biāo)記可能會使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或使融合蛋白功能喪失。

以上兩種方法都要共同的缺點：假陽性。實驗所檢測到的相互作用可能時由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用;蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的;有時會檢測到兩種在細胞中不可能相遇卻有ji強親和力的蛋白。因此實驗結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗證。

●免疫 共沉淀 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進行，可以避免認(rèn)為影響;可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。 缺點：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物時候為直接相互作用的兩種蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。

●Far-Western 又叫做親和印記。將PAGE膠上分離好的凡百樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測哪種蛋白能與標(biāo)記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作用，最后顯影。 缺點是轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白復(fù)性。

2. 等離子表面共振技術(shù)(Surface plasmon resonance)

該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌"蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射綠上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點：需要專門的等離子表面共振檢測儀器。

3. 遺傳學(xué)方法

使某處發(fā)生缺損，檢測對其他地方的影響。

●基因外抑制子。基因外抑制子是通過一個基因的突變 來彌補原有基因的突變。比如相互作用的蛋白A和B，如果A發(fā)生了突變使兩者不再相互作用，此時B如果再發(fā)生彌補性突變就可以使兩者的相互作用恢復(fù)，那么B就是A的基因外抑制子。 缺點：需要知道基因，要有表型，篩選抑制子比較費時。

●合成致死篩選 指兩個基因同時發(fā)生突變會產(chǎn)生致死效應(yīng)，而當(dāng)每個基因單獨發(fā)生突變時則無致死效應(yīng)。用于分析兩個具有相同重要蛋白之間的相互作用。

4. 雙雜交技術(shù)

原理基于真核細胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個或以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細胞中表達，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報告基因。 缺點：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會造成假陽性。融合蛋白會影響蛋白的真實結(jié)構(gòu)和功能。不利于核外蛋白研究，會導(dǎo)致假隱性。

5. 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

指兩個熒光法色基團在足夠近(<100埃)時，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對某些刺激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測大分子的構(gòu)象變化，能夠定性定量的檢測相互作用的強度。 缺點 此項技術(shù)要求發(fā)色基團的距離小于100埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標(biāo)記。

此外還有交聯(lián)技術(shù)(cross-linKing)，蛋白質(zhì)探針技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)(Phage display)以及生物信息學(xué)的方法來檢測蛋白質(zhì)之間相互作用。