研究基因功能的生物醫(yī)學(xué)小白在課題zui開(kāi)始往往都是從構(gòu)建一些必要的載體入手。那面對(duì)眼花繚亂的載體list（無(wú)論是Addgene還是公司）小白們geng是無(wú)從下手。讀完本文，小白們會(huì)在一夜之間成為載體構(gòu)建的“老si機(jī)”。
大體上來(lái)說(shuō)，我們研究功能無(wú)非就是在體外（in vitro）和體內(nèi)（in vivo）兩種實(shí)驗(yàn)體系中對(duì)我們的目的基因功能加以描述，如圖1所示。
圖1 基因功能研究的兩種類型。
對(duì)于體外研究中的細(xì)胞系（或者原代細(xì)胞），我們geng多會(huì)選擇轉(zhuǎn)染、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或者腺病毒；而對(duì)于體內(nèi)研究，我們主要選擇購(gòu)買(mǎi)遺傳修飾的動(dòng)物模型，或者直接選用AAV介導(dǎo)的遺傳干預(yù)。
基因功能研究無(wú)非就是三種手段-①過(guò)表達(dá)、②敲低（減）表達(dá)、③敲除，剩余的就是檢測(cè)這三種干預(yù)手段對(duì)功能表型的定量和定性影響。下面我們分述在哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)施這三種干預(yù)手段分別對(duì)應(yīng)的載體選擇。
一、過(guò)表達(dá)
過(guò)表達(dá)的意思就是人為過(guò)量表達(dá)你的目的基因。這一類型的載體選擇主要關(guān)注一下兩點(diǎn)：
1、啟動(dòng)子
對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，常見(jiàn)載體的泛表達(dá)啟動(dòng)子常見(jiàn)的基本就這幾個(gè)-CMV, SV40, EF1a, CAG。大部分都選擇CMV、CAG或者EF1a其中之一即可，SV40表達(dá)能力稍弱。但對(duì)于免疫細(xì)胞、干細(xì)胞我們推薦選擇EF1a即可。
比如圖2所示的載體是哺乳動(dòng)物zui常用的過(guò)表達(dá)載體。需要說(shuō)明的是，對(duì)于其他模式生物的細(xì)胞，比如細(xì)菌、酵母、果蠅、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、爪蟾等并不適用。
圖2 pCDNA3.1是哺乳動(dòng)物中過(guò)表達(dá)zui常用的商業(yè)化載體類型。其目的基因得分啟動(dòng)子是CMV。
2、標(biāo)簽
如果過(guò)表達(dá)是編碼蛋白的基因，通常我們會(huì)建議加個(gè)標(biāo)簽（Epitope tag）。其目的是給過(guò)表達(dá)的目的基因做個(gè)特殊標(biāo)記，從而有利于后續(xù)的檢測(cè)（你的過(guò)表達(dá)確定表達(dá)了么？表達(dá)量如何？）。
所以這種標(biāo)簽通常體積較小，不會(huì)影響目的蛋白的構(gòu)象、定位、功能等。比較常用的標(biāo)簽有FLAG、HA、Myc、GFP等，我們一個(gè)基因通常只需選一種即可，不過(guò)有時(shí)候這些標(biāo)簽需要多串聯(lián)幾個(gè)（比如，3´FLAG，3´HA，6´Myc等）一起增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度。我們不講標(biāo)簽的區(qū)別，他們本質(zhì)上都是一段可以編碼蛋白的基因片段。
載體構(gòu)建的時(shí)候我們的目的基因跟這些標(biāo)簽都是融合表達(dá)在一起的（通常標(biāo)簽位于目的基因的下游，也叫做（基因的）3‘端，（蛋白的）C端）（圖3），后續(xù)我們只需要購(gòu)買(mǎi)能特異性識(shí)別對(duì)應(yīng)標(biāo)簽的抗體做免疫印跡或者免疫熒光檢測(cè)即可。
圖3 實(shí)例：過(guò)表達(dá)基因下游帶有融合3´FLAG的載體
3、選擇標(biāo)記
選擇標(biāo)記（Selectable Markers）主要目的是區(qū)分表達(dá)于非表達(dá)目的基因的細(xì)胞。
常見(jiàn)的選擇標(biāo)記有Puromycin、Blasticidin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin和各種熒光蛋白如ZsGreen、EGFP、RFP、mCherry等。
Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin是一類可以用對(duì)應(yīng)的小分子藥物篩選的標(biāo)記；熒光蛋白標(biāo)記可以借助熒光顯微鏡直觀的觀察到表達(dá)目的基因的細(xì)胞，也可以直觀的估計(jì)感染效率等。
所以，原則是如果允許，Puromycin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin中的一種其中一個(gè)，比如puromycin（zui常用），和熒光蛋白標(biāo)記中的任選一個(gè)，比如ZsGreen（zui常用）等。實(shí)例如圖4所示。
圖4 實(shí)例。此過(guò)表達(dá)載體帶有綠色熒光蛋白ZsGreen和Puromycin雙重標(biāo)記。
二、敲低（減、降）表達(dá)
這類載體的選擇要簡(jiǎn)單很多，啟動(dòng)子選擇U6即可。但標(biāo)記選擇通常跟過(guò)表達(dá)類似，盡量選Puromycin和ZsGreen，如圖5所示。
圖5 帶有ZsGreen和Blasticidin（BSD）雙重標(biāo)記的敲減型載體。
三、敲除載體
目前zui常用的就是CRISPR-Cas9的基因敲除載體，該系統(tǒng)是個(gè)二元結(jié)構(gòu)，需要在同一個(gè)細(xì)胞中一起表達(dá)Cas9和針對(duì)目的基因的sgRNA。目前所用的載體有二合一的，也有分開(kāi)兩個(gè)載體的。我們優(yōu)先推薦二合一型載體。
此類型的載體也是U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的載體，由于Cas9體積過(guò)大，通常這類二合一載體僅會(huì)帶有一個(gè)標(biāo)記，如Puromycin或GFP，但也有人用同時(shí)帶有兩個(gè)標(biāo)記的載體。如圖6所示。
圖6 基于CRISPR-Cas9的基因敲除載體。我們發(fā)現(xiàn)該載體帶有ZsGreen標(biāo)記。同時(shí)Cas9C端融合FLAG標(biāo)簽。
注意：
- 對(duì)于腺病毒載體，由于其感染效率*，通常只需要帶熒光蛋白單個(gè)標(biāo)記即可，但推薦編碼蛋白的目的基因過(guò)表達(dá)時(shí)帶常見(jiàn)標(biāo)簽融合表達(dá)；
- 對(duì)于在體基因功能研究，我們常用AAV載體，這類載體我們往往只需要待單個(gè)熒光蛋白標(biāo)記即可，但推薦編碼蛋白的目的基因過(guò)表達(dá)時(shí)帶常見(jiàn)標(biāo)簽融合表達(dá)。
總結(jié)
繁雜的載體類型，我們只需要按照①過(guò)表達(dá)、②敲低（減）表達(dá)、③敲除分類，按照上述原則簡(jiǎn)單選擇目的載體即可。即使我們看不太懂質(zhì)粒圖譜也可以做出快速正確的選擇。
