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遠慕新聞:植物組織樣本的前處理方法
點擊次數(shù):604 更新時間:2020-08-03

植物DNA的提取和純化是植物基因工程研究的基礎(chǔ)操作。實施分子標記、基因圖譜、基因指紋圖譜、基因文庫構(gòu)建、遺傳多態(tài)性分析、DNA重組、RAPD(隨機引物多態(tài)性DNA)、RFLP(限制性酶多態(tài)性)、基因分離及遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定等都以提取DNA為前提。

目前,對從植物組織中提取DNA方法的要求是:簡便、有效、快捷以及經(jīng)濟。與動物組織相比,植物組織含有較多的多糖和其他次生代謝產(chǎn)物(酚、酯、萜、色素等),這給高質(zhì)量的DNA提取帶來較多的困難。尤其是多糖成分是影響DNA純度-常見的問題。如何做到既去除這些污染物又能相對保持高的產(chǎn)量,并且能簡捷有效地提純,一直是植物生物技術(shù)研究者探索的問題。

對于普通的植物(低酚、低酯、低糖等)如:水稻、白菜、莧菜、南瓜、黃瓜、西紅柿、上海青、菠菜、筍瓜、冬瓜、蓮藕、山藥、竹筍等;我們可以選用普通植物DNA提取試劑盒(磁珠法)試劑

對于多糖、多酚類植物(香蕉、西瓜、蘋果、梨等果肉,紅薯、馬鈴薯等塊莖,棉花、月季、枇杷、益母草、夏枯草等人參、曼陀羅、向天果、射干、桔梗、滿山紅、金雞納霜等藥用植物)可以選用多酚植物DNA提取試劑盒(磁珠法)試劑,針對類似的植物我們經(jīng)過長期的優(yōu)化,可以得到較好的實驗結(jié)果。

以葉片為例,葉片需先剪碎成小塊,以便放入1.5ml離心管。-佳樣本的長度應(yīng)在1cm 以下。重量不超過250mg,推薦使用50mg,如果是植物種子粉末可以使用10mg-20mg粉末即可。

一、勻漿介質(zhì)

一般采用 0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測定方針的狀況自行設(shè)定濃度,目的是堅持樣本的等滲環(huán)境。

二、組織勻漿的制備

1、取組織塊(0.2g~0.5g)可到 5~10mg 在嚴寒的 PBS 中漂洗,濾紙拭干,稱重,放入 5ml 的勻漿管中。

2、按重量 (g):體積 (ml)=1:4 的比例參與 4 倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中,冰水浴條件下,用眼科小剪趕快剪碎組織塊。  

3、勻漿的方法:手工勻漿,機器勻漿。

① 手工勻漿:左手持勻漿管將下端刺進盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿筆直刺進套管中,上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次(6~8 分鐘),充沛研碎,制成 20% 的勻漿液。

② 機器勻漿:用組織搗碎機 10000~15000 轉(zhuǎn) / 分 上下研磨制成 20% 組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備(勻漿時間 10 秒 / 次,空隙 30 秒,接連 3~5 次,在冰水中進行,可適當(dāng)延伸勻漿時間),

4、將制備好的 20% 勻漿液用一般離心機或低溫低速離心機 4000 轉(zhuǎn) / 分左右,離心 10~15 分鐘,取上清液進行測定.

三、樣本保存

植物組織樣本暫時不測定,可立即低溫凍存,溫度越低越好,中心如不重復(fù)凍融,-20 ℃ 以下可保存三個月,-70 ℃ 以下可保存六個月。 制備好的勻漿液主張不要凍存,當(dāng)天進行測定,如放置時間過長相關(guān)酶活會有所下降,部分方針 4 ℃ 可存放 3~5 天(如 SOD 要存放 2~3 天,MDA 可存放 3~5天,總蛋白測定可存 5~7 天)。

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