咱就是說(shuō)細(xì)胞想要長(zhǎng)期保存，那肯定是需要凍存起來(lái)放液氮保存。那怎樣凍存細(xì)胞才能保證細(xì)胞能正常復(fù)蘇，不至于凍存死亡呢？下面遠(yuǎn)慕就來(lái)講講細(xì)胞凍存應(yīng)該注意的一些地方。

1. 保持凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好

凍存前一定要保證細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，否則不管后面怎么處理，凍存后的細(xì)胞狀態(tài)必然有影響。若細(xì)胞密度偏高，培養(yǎng)基已經(jīng)略微變黃，細(xì)胞狀態(tài)正常，需要換液培養(yǎng)2h以上再凍存細(xì)胞；若已wan全變黃，細(xì)胞死亡超過(guò)20%，需要傳代后再重新培養(yǎng)至狀態(tài)正常后再凍存細(xì)胞。

2. 消化、吹打細(xì)胞按盡量輕柔

如何正確消化、吹打細(xì)胞在前面已經(jīng)講過(guò)了，有興趣的話可以到以往文章里看看，這里就不再贅述了。凍存后細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿肯定還是會(huì)殘留一點(diǎn)細(xì)胞，這些殘留的細(xì)胞加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如果培養(yǎng)正常就可以看出凍存時(shí)消化、吹打操作是沒(méi)有問(wèn)題的，如果直接死了或者狀態(tài)不好，那凍存的細(xì)胞自然也好不到哪里去，問(wèn)題出在哪就很明顯了。

3. 凍存液配方要給合適的

凍存液配方這個(gè)其實(shí)不同實(shí)驗(yàn)室都有自己的習(xí)慣，有FBS+10%DMSO的，也有wan全培養(yǎng)基+10%DMSO的，還有基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血清+DMSO=7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以說(shuō)是五花八門(mén)，但總體來(lái)說(shuō)，DMSO一般是不超過(guò)12%的，血清濃度越高凍存效果也越好，因此需要多凍幾次對(duì)比合適的配方。

4. 凍存液要提前配置

凍存液使用時(shí)要提前配好，不能直接在細(xì)胞懸液中加DMSO凍存細(xì)胞，否則DMSO溶解時(shí)濃度不均加上溶解放熱會(huì)損傷細(xì)胞活性?？梢袁F(xiàn)配先用，也可以多配一點(diǎn)，4度最多可以保存3個(gè)月，-20度可以保存一年。細(xì)胞用凍存液重懸后應(yīng)盡快放到4度或者程序性凍存盒開(kāi)始凍存，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫狀態(tài)，因?yàn)槭覝貤l件下DMSO對(duì)細(xì)胞是有害的。

5. 凍存細(xì)胞數(shù)量選擇

通常來(lái)說(shuō)，凍存細(xì)胞都會(huì)有一部分細(xì)胞死亡，所以凍存剩下的活細(xì)胞數(shù)量才是決定細(xì)胞復(fù)蘇后能否正常養(yǎng)起來(lái)的關(guān)鍵。一般凍存不容易死的細(xì)胞數(shù)量每管在100-200萬(wàn)就夠了，一些凍存很容易死的細(xì)胞，比如NK92、THP-1、SF9等細(xì)胞數(shù)量要稍微高點(diǎn)，300-400萬(wàn)左右為宜。凍存液一般1ml左右每管，這個(gè)基本每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都差不多。

6. 凍存程序選擇

凍存的時(shí)候可以選擇用程序性凍存盒直接放到-80度凍存細(xì)胞，但要記得異丙醇要及時(shí)更換，一般用4-5次異丙醇含水量就超標(biāo)了，不再適合凍存細(xì)胞使用。也可以將凍存管依次在4度10min，-20度2h，-80過(guò)夜后液氮保存。-80度不適合細(xì)胞長(zhǎng)期保存，只能短期保存，最好不要超過(guò)一周，否則有部分細(xì)胞系活性可能會(huì)下降很厲害，長(zhǎng)期保存的細(xì)胞最好放液氮罐保存。

7. 注意凍存檢查

凍存細(xì)胞后應(yīng)在同一批次內(nèi)隨機(jī)選一只細(xì)胞復(fù)蘇檢測(cè)凍存效果， 如果復(fù)蘇效果不佳的話需要找到問(wèn)題所在摸索合適條件重新凍存細(xì)胞，如果復(fù)蘇良好的就可以放到液氮里長(zhǎng)期保存了。這個(gè)也是前面推薦將凍存剩下的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的原因，可以有效避免細(xì)胞凍存失敗導(dǎo)致絕種。